È la distanza verticale nello spazio dell'immagine (sul piano della pellicola), dall'alto e dal basso del piano esatto dell'immagine, che appare sufficientemente nitida. Contrariamente a quanto ci si potrebbe aspettare, la profondità di messa a fuoco è più bassa per obiettivi a basso ingrandimento. Questo rende più difficile ottenere immagini nitide, in fotomicrografia, con obiettivi a bassa potenza.

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